Approved Abstracts

Otimização de protocolos para a análise da expressão da vitelogenina plasmática de Oreochromis niloticus



Author(s): Morais, T.P; Vargas, D.A.R; Souza, T.L; Barreto, L.S; Ferreira, F.C.A.S; Opuskevitch, I; Yamamoto, F.Y; Ribeiro, C.A.O;
Presenter: Tobias Pereira de Morais

Atualmente existem diversas técnicas moleculares que permitem avaliar a desregulação endócrina, em diversos grupos taxonômicos. Tais técnicas vêm se aprimorando ao longo dos tempos, no entanto, devido à falta da padronização para a aplicação de algumas dessas técnicas para determinados organismos, torna-se necessário o desenvolvimento de novos protocolos que confiram confiabilidade e reprodutibilidade destas análises. Portanto, este estudo tem como objetivo apresentar a padronização de técnicas moleculares como western blotting e Elisa de Captura, para a detecção da glicolipofosfoproteína vitelogenina, considerada como um dos principais biomarcadores moleculares de desregulação endócrina. Para o desenvolvimento do trabalho, foi utilizado o plasma de tilápia, Oreochromis niloticus, um modelo biológico amplamente utilizado em diversos estudos a nível global. Para a padronização da técnica de western blotting, foram testados os seguintes parâmetros: plasma de tilápia macho induzido com α-etinilestradiol (20 mg EE.kg-1 peixe) e plasma de tilápia macho não induzido. As duas amostras foram normalizadas na concentração de 20 µg de proteínas totais para a realização do teste. A afinidade e especificidade de 3 anticorpos produzidos no Laboratório de Toxicologia celular da UFPR: anti-Geophagus brasiliensis, anti-Rhamdia quelen e anti-VTG-R (vitelogenina recombinante produzida em Escherichia coli) em três concentrações diferentes e o anticorpo secundário, na diluição 1:10000. Para o Elisa de captura os parâmetros testados foram concentrações diferentes dos mesmos anticorpos mencionados e 50 e 100 µg/well das amostras do controle positivo (VTG-R), tratamentos das amostras de plasma de tilápia macho induzido (TPI) e não induzido (TPN) e controle negativo (albumina de soro bovino - BSA). Após os ensaios de padronização, pôde-se verificar que o anticorpo anti-Geophagus brasiliensis na menor concentração (0,5 µg/mL) se mostrou altamente sensível para a técnica de western blotting, com um padrão semelhante ao anticorpo monoclonal contra vitelogenina de zebrafish (Danio rerio) e superior ao anticorpo policlonal contra vitelogenina de algumas espécies de peixes, como relatado na literatura. Este resultado denota a qualidade do anticorpo produzido, visto que com uma menor quantidade e consequentemente menor custo aferiu-se uma melhor detecção da proteína de interesse, com alta especificidade. No Elisa de captura, o anticorpo anti-VTG-R mostrou-se mais adequado com uma alta afinidade pelo antígeno, mesmo em concentrações muito baixas (0,1 µg/mL). O anticorpo teve um desempenho similar àquele observado em uma proporção 4x maior comparado ao próprio anticorpo, indicando alta afinidade pelo alvo, significando ser capaz de reconhecer uma quantidade mínima do alvo na amostra biológica, demonstrando assim também que tal anticorpo produzido possui um alto potencial para ser utilizado em técnicas que avaliem a desregulação endócrina dos peixes, devido a sua eficácia, sensibilidade e especificidade. A padronização das técnicas moleculares pode ser efetivada com sucesso, após muitos testes e provavelmente dificuldades, pois são muitos parâmetros envolvidos e até que todos estejam em condições ideais, isso pode demandar tempo e disposição para a realização da mesma, no entanto, é de extrema necessidade para resultados mais elucidativos e precisos. Com isso, através dos testes realizados com os diferentes parâmetros nesse estudo, como, anticorpos, concentrações dos anticorpos, diluições das proteínas plasmáticas totais e diferentes reagentes, foi possível definir as melhores condições para a detecção da vitelogenina plasmática de O. niloticus. Esta otimização é importante para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade da análise, que poderá ser aplicada em diversos estudos que envolvam tal espécie.

Keywords: Vitelogenina; Técnicas moleculares; Desregulação endócrina

[back]



Confirmed
Speakers


Venue
HOTEL HIMMELBLAU

Hotel Himmelblau has a family tradition of over 40 years, operating and offering the very best in hospitality. Located in the central region of the city, we are close to the main attractions of Blumenau, next to Shopping Neumarkt and at a distance of 2km from Vila Germanica Park.

Rua 7 de Setembro - 1415 - Centro
Blumenau - Santa Catarina - Brasil
CEP: 89010-203


Any questions?

Please send a message to us!